Анализ с множественными внутренними контрольными образцами



Интерпретация результатов ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является мощнейшим инстументом современной молекулярной биологии. Так как в процессе реакции амплифицируется спецефический участок ДНК, ПЦР имеет огромный потенциал для использования в современной ветеринарной практике. Целевыми фрагментами для анализа могут быть, как и функциональные гены, так и отдельные консервативные или вариабельные локусы. Данные фрагменты называются молекулярно-генетическими маркерами. Благодаря молекулярным маркерам стало возможно проводить селекцию животных на совершенно новом уровне, значительно сокращая время выведения новых (или улучшения существующих) пород. Кроме того, молекулярно-генетические маркеры позволяют вести эффективный скрининг племенных животных по наследственным заболеваниям. Вторая особенность молекулярных маркеров – возможность определения видовой принадлежности любого организма – позволяет создавать очень точные и чувствительные тест-системы для детекции возбудителей различных заболеваний (в том числе бактериальных, грибковых, протозойных и вирусных – с точностью вплоть до отдельных штаммов, патотипов или изолятов) и определять состав кормов и сельскохозяйственной продукции (по наличию ДНК организмов, из которых они были изготовлены).

Более информативной и точной модификацией «классической» ПЦР является ПЦР в реальном времени. Этот метод является количественным (или полуколичественным) – в процессе ПЦР происходит постоянное наблюдение образца датчиком, регистрирующим флуоресцентные сигналы на каждом цикле реакции. Полученные в результате амплификационные кривые используются в дальнейшем анализе – по ним можно оценить, например, интенсивность экспрессии определенных генов (и, в следствии, проявление фенотипических признаков или наследственных заболеваний), вирусную нагрузку на организм больного животного (что позволяет выявить заболевание на ранних стадиях), оперативно (в отличие от бактериальных посевов) и точно (в отличие от ИФА) диагностировать бактериальные и протозойные заболевания.

Рассмотрим основные моменты, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов ПЦР в реальном времени на примере исследования экспрессии генов.

Подготовка материала – выделение РНК.

Принцип выделения для всех нуклеиновых кислот один и тот же – лизис биоматериала, осаждение нуклеиновых кислот на субстрат, очистка от белков, жиров, углеводов, солей и клеточного дебриса, и элюция нуклеиновых кислот в раствор.
РНК является намного более лабильной молекулой, чем ДНК. Процесс деградации рибонуклеиновых кислот происходит на порядок быстрее. Этому способствует, во первых, их одноцепочечная структура, во вторых – большое количество РНКаз (ферментов, расщепляющих РНК), которые присутствуют как и в самих клетках, из которых производят выделение, так и на поверхности кожи оператора (и всех предметов и оборудования, с которыми он контактировал). Тем более, во многих протоколах выделения ДНК применяется дополнительная обработка образца РНКазами – появляется еще один источник контаминации рабочего места.
Рассмотрев эти особенности, можно выделить ряд обязательных для соблюдения правил подготовки образцов РНК:

  • Для уменьшения деградации от эндогенных РНКаз забор биоматериала должен быть проведен непосредственно перед выделением, биоматериал должен быть заморожен в жидком азоте. (Для
    разных наборов реактивов условия могут быть разными. Более подробные рекомендации описаны в протоколах выделения.)
  • Работать исключительно в перчатках и масках. Перчатки, посуду, оборудование и все рабочие поверхности следует обработать деактиватором РНКаз (чаще всего раствором ДЕПК).
  • Использовать воду, свободную от РНКаз (RNAse free).
  • Не допускать хранения образцов РНК и реактивов для их выделения рядом с растворами РНКаз.

Результаты ПЦР в реальном времени

Что можно измерить с помощью ПЦР в реальном времени?

Если вам необходимо проанализировать экспрессию генов, ПЦР в реальном времени может показать количество мРНК в образцах. В результате реакции амплифицируется небольшой регион мРНК, с помощью олигонуклеотидов и флуоресцентного зонда (как в методике TaqMan). Амплификатор (прибор, в котором происходит ПЦР) измеряет интенсивность флуоресценции зондов в образцах на протяжении каждого цикла. На первых циклах уровень флуоресценции недостаточен, чтобы его мог детектировать прибор, но при дальнейшем прохождении реакции он возрастает многократно. Кривая амплификации имеет так называемую экспоненциальную фазу, после которой следует фаза плато.

Ct (пороговый цикл) обозначает определенный цикл реакции и представляет собой одно из ключевых значений ПЦР в реальном времени. Пороговый цикл наступает, когда график кривой амплификации переходит в экспоненциальную фазу (на этой фазе отрезок кривой амплификации линейный). Порог (порог чувствительности, пороговое значение), который обозначен на рисунке красной прямой, пересекает кривую амплификации в точке наступления экспоненциальной фазы. Порог чуствительности может быть разным для разных видов анализа (если, например, используются разные методики анализа или исследуются разные гены), но всегда одинаковый для всех образцов в одной выборке (или в одном эксперименте).

Суть ПЦР в реальном времени заключается в том, что в каждом цикле реакции количество продукта удваиватся по сравнению с предыдущим. Если, например, значение Ct для двух реакций отличается на 2 цикла (см. рисунок), можно сделать вывод, что в образце А (обозначен фиолетовым графиком) в 4 раза больше копий мРНК, чем в образце Б (обозначен оранжевым графиком).

Чаще всего, данные, полученные в результате ПЦР в реальном времени, позволяют оценить так называемую «относительную экспрессию», то есть, насколько различается интенсивность экспрессии определенного гена у двух организмов. Однако, методика позволяет оценить и абсолютное значение экспрессии генов, но для этого необходимо создать стандарт, в роли которого обычно выступают клонированные целевые участки кДНК, интегрированные в вектор.

Словарь терминов:

Внутренний контроль (внутренний контрольный образец, ВКО). Контрольный ген, который присутствует во всех образцах в выборке.
Например, GAPDH, ACTB, TBP, HPRT, PPIA, YWHAZ.

Калибровочный образец. Калибровочным называют образец, по которому ведется сравнение полученных данных. Он представляет собой точку отсчета (time-zero). Значение RQ для контрольного образца равно 1, так как в таком случае он сравнивается с самим собой.

Ct = Пороговый цикл. Обычно ПЦР в реальном времени проходит в течение 40 циклов. Пороговый цикл наступает тогда, когда кривая амплификации пересекает линию порога чувствительности прибора (в месте, где график кривой амплификации становится линейным). Это значение необходимо для анализа. Чем выше значение порогового цикла (Ct=30-35), тем меньше мРНК находится в образце, так как нужно больше времени для амплификации необходимого для интенсивной флуоресценции количества копий мРНК. Если значение Ct невелико (10-15), это свидетельствует о том, что ген экспрессируется очень активно. Обычно внутренний контрольный образец имеет меньшее значение Ct, чем исследуемые гены.

Дельта Ct = Ct исследуемого гена – Ct внутреннего контрольного образца

Дельта Дельта Ct = ΔCt образца 1 – ΔCt калибровочного образца

Дельта Ct SD = Стандартное отклонение. Стандартное отклонение рассчитывается программным обеспечением по обработке данных анализа на основании значений Ct в трехкратном повторении. Данные достоверны, если Стд. откл. меньше 0,25. Если Стд. откл. Более 0,25, значению RQ доверять нельзя.

Похожее:  Условия повышающие качество знаний обучающихся статья на тему

Реплики. Повторения (так называемые реплики) можно разделить на технические и биологические. Технической репликой является амплификация одного и того же материала, биологические реплики предполагают выделение мРНК и амплификацию из разного биологического материала.

RQ = Относительное количество = 2 – ΔΔCt. Значение RQ показывает количество продукта амплификации в технических репликах относительно калибровочного образца. Все образцы в рамках эксперимента будут сравниваться с калибровочным.

Например, если RQ=10, это значит, что в исследуемом образце экспрессия проходит в 10 раз более активно, чем в калибровочном. Значение RQ=0,1 говорит о том, что в исследуемом образце экспрессия проходит в 10 раз менее активно, чем в калибровочном.

Достоверными могут считаться данные, если RQ больше 2 или меньше 0,5. Это зависит от особенностей методики. Не исключено, что для одного и того же образца в один день можно получить значение RQ=0,8, а на следующий – 1,2. Если в ваших образцах предполагается малый разброс RQ (отличие в 1,5 раза от каибровочного образца), для анализа следует сделать биологические реплики образцов и они должны быть очень хорошо очищены. Кроме того, для каждого гена необходимо провести по 2 анализа и использовать ПКО с известным RQ.

RQmin и RQmax = диапазон возможных значений RQ с учетом стандартного отклонения ΔCt. Доверительный интервал должен быть 95%.
Если вам необходимо узнать действительную ошибку RQ, следует делать трехкратные биологические реплики. Это позволит выполнить тест Стьюдента для различных групп повторений.

Общее качество данных

При анализе полученных данных удостоверьтесь, что кривые амплификации не имеют резких пиков и параллельны друг другу. Технические реплики должны быть просканированы в пределах 0,5 цикла. Значения Ct должны быть <35. Если вы подозреваете, что кривая амплификации имеет нехарактерный вид, отбросьте данный образец из анализа. Если экспоненциальная фаза начинается позже 35-го цикла, отбросьте данный образец из анализа, либо используйте эти данные с большой осторожностью, удостоверившись, что повторения однообразны.

Если у вас нет доступа к кривым амплификации, и вам необходимо проверить достоверность результатов анализа, можно использовать значения Ct SD или ΔCt SD. Это поможет вам оценить однородность повторений. Значения ΔCt SD <0,25 являются хорошими. Это значение говорит лишь о технической точности измерений. Для большей точности необходимо делать биологические реплики.

Если все гены в ваших образцах выходят на экспоненциальную фазу слишком поздно (включая внутренний контрольный образец) и ваши данные, в целом, имеют плохой вид, следует проверить качество РНК. Низкое качество РНК – основная причина получения плохих результатов анализа. Убедитесь, что РНК не деградировала (с помощью гель-электрофореза или анализатора) и не загрязнена (проверьте коэффициенты поглощения 260/280 и 260/230).

Анализ с множественными внутренними контрольными образцами

Использование двух или более внутренних контрольных образцов крайне рекомендуется, это позволит значительно повысить точность ваших результатов. Протестируйте несколько ВКО и выберите из них тот, который дает меньший разброс между образцами.

Источник

Принцип ПЦР исследования

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…

Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.

Как работает ПЦР?

Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.

Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.

Почему реакция называется полимеразная цепная?

ПЦР – сложный, высокотехнологичный процесс. Для реакции используется шаблонная ДНК (исходная) и праймеры – короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые будут связываться с шаблонной ДНК. Сначала происходит разъединение двухцепочечной ДНК (шаблона) при высоких температурах, затем праймеры соединяются с одноцепочечной матрицей. Далее фермент ДНК-полимераза собирает цепь ДНК (полимер) из нуклеотидов (мономеров). Число фрагментов растёт в геометрической прогрессии, отсюда название «цепная реакция». В качественном методе для обнаружения собранной ДНК используют особые метки. Если ДНК микроба выявлена, произойдёт свечение. Если ПЦР не запустилась, значит, свечения не будет, и данного возбудителя в исследуемом материале нет. Количественные тесты проводятся в режиме реального времени (ПЦР real time), когда количество копий ДНК фиксируют оптические датчики, встроенные в прибор — амплификатор.

В чём преимущества ПЦР?

  1. Высокая специфичность. Происходит копирование конкретного заданного участка, принадлежащего тому микроорганизму, который мы хотели бы обнаружить. При отсутствии молекул нужной ДНК реакция не пойдёт, даже если в растворе окажутся тысячи других ДНК.
  2. Высокая чувствительность. ДНК возбудителя будет выявлено даже при наличии минимального количества микроорганизма. Поэтому ПЦР выявляет скрыто протекающие инфекции
  3. Возможно исследование любого биологического материала
  4. Проведение ПЦР возможно в случаях, когда объем материала минимален. Это актуально в педиатрии, офтальмологии, неврологии, судебно-медицинской экспертизе.
  5. ПЦР выявляет микроорганизмы, не вырастающие в бакпосевах. Их называют труднокультивируемые и к ним относят все вирусы, хламидии, микоплазмы и т.д.
  6. ПЦР называют прямым методом, поскольку он выявляет возбудителя, а не иммунную реакцию организма, и является подтверждающим методом в диагностике инфекционных заболеваний

Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:

ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:

  • Для правильной расшифровки результата необходимо сопоставлять клинические данные и результаты ПЦР, с чем лучше всего справится врач.
  • Для оценки эффективности лечения ПЦР проводится не ранее чем через месяц после окончания антибактериальной терапии (чтобы возбудитель полностью вывелся из организма)
Похожее:  Крот животное Описание особенности виды образ жизни и среда обитания крота

Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:

  • При исследовании материала урогенитального тракта важно соблюдать интервал 5-7дней между повторными мазками, чтобы клетки успели восстановиться

Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:

  • Нельзя проводить исследование материала урогенитального тракта во время менструации
  • Перед исследованием важно очистить нос, зев и другие локусы от слизи и гноя

Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:

Источник

Результаты анализов ПЦР

ПЦР-исследования уже долгое время входят в спектр лабораторно-диагностических исследований различных заболеваний.

За несколько десятилетий развития и совершенствования, методика стала для дерматовенерологической службы незаменимой.

В данной статье вы узнаете

Что представляют из себя ПЦР исследования и их результаты.

Полимеразная цепная реакция — это метод диагностики, позволяющий идентифицировать возбудителя того или иного заболевания.

Искомым фактором служат уникальные последовательности генетического материала, которые присутствуют в микробной клетке только одного вида или штамма патогенных микроорганизмов.

Чаще всего целью исследования является ДНК бактерии или вируса, но метод ПЦР предоставляет результаты и по РНК микроорганизмов.

Результаты ПЦР анализов.

Для чего используются различные биологические материалы:

  • слюна
  • биоптат ткани
  • моча
  • спинномозговая жидкость
  • кровь
  • соскобы со слизистых оболочек

Результаты ПЦР диагностики представляют собой

данные о наличии или отсутствии заболевания это – наиболее простая, доступная информация.

Есть такие методики ПЦР, результаты анализов которых кроме установления самого факта инфицирования, позволяют оценить активность инфекции, динамику болезни и отклик на проводимое лечение.

Такой вариант называется «полимеразно-цепная реакция в реальном времени», максимально широко применяется в отношении пациентов с гемотрансмиссивными хроническими вирусными инфекциями – гепатитами, ВИЧ.

Главное преимущество методики – высочайшая чувствительность и специфичность.

Такие анализы быстро проводятся и очень точны.

Представляя достоверные данные, позволяют начать лечение как можно раньше.

своевременное лечение ЗППП

ПЦР исследование состоит из трех этапов:

  • Подготовка образца после взятия материала.
  • Собственно полимеразная реакция, которая состоит в многократном копировании фрагментов материала.
  • Интерпретация результатов.

Результаты анализов ПЦР положительны, если предполагаемый возбудитель обнаружен.

Если же нет — результат отрицательный.

Как таковой, утвержденной формы бланка результатов анализов нет.

Это связано с тем, что исследование и фиксацию данных проводит компьютер.

Соответственно, графы и данные в бланк вносятся так, как предусматривает программное обеспечение, под управлением которого работает аппарат.

Поэтому расшифровка результатов анализов требует от врача особой подготовки и опыта.

В случае, когда проводится полимеразно-цепная реакция в реальном времени, в бланке результатов анализов еще отдельно указывается количество выявленных копий генетического материала искомого микроорганизма.

Разумеется, если таковые будут выявлены в принципе.

Положительный результат

Все возбудители венерических заболеваний и гемотрансмиссивных инфекций (гепатиты, ВИЧ), попав в организм человека начинают размножаться, но при этом никак себя не проявляют.

Здесь имеет место так называемый инкубационный период или торпидное, скрытое течение инфекции.

В подобных случаях ПЦР все равно находит в диагностическом материале генетические маркеры возбудителей уже через несколько дней от момента заражения.

Для того, чтоб анализ стал положительным, достаточно одной молекулы ДНК или РНК патогенного микроорганизма в собранном диагностическом материале.

Для многих ранних аппаратов существует технологический порог чувствительности в 40 микробных тел.

Но, как правило, если человек действительно заражен той или иной венерической болезнью или ЗППП, то у него возбудителей в пробах бывает больше этого числа и анализ будет положительный.

Отрицательный результат

По большому счету, такой вариант возможен в двух случаях: человек не заражен или неправильно собран диагностический материал.

Конечно, нельзя исключать, что концентрация возбудителей в исследуемой пробе может оказаться ниже, чем порог чувствительности аппарата.

Но такая ситуация встречается крайне редко, и если у доктора есть сомнения, то анализ всегда можно повторить спустя некоторое время.

Если результаты диагностики ПЦР останутся отрицательными, то человек здоров.

В противном случае, при получении вторых анализов положительными, это значит, что пациент заражен и необходимо начинать его лечение.

Расшифровывать результаты ПЦР анализа должен лечащий врач

Расшифровывать результаты ПЦР анализа должен лечащий врач , которому известен ход лечения.

Идеально, чтоб это был тот же специалист, который проводит сбор диагностического материала для проведения исследования, может наблюдать пациента и отслеживать все изменения в здоровье человека.

К сожалению, клиническое течение современных венерических заболеваний и инфекций сильно отличается от классического.

В таких случаях даже результаты анализов ПЦР необходимо подкреплять данными других исследований:

  • микроскопия мазка отделяемого половых органов, из уретры
  • серологические реакции крови на антитела к определенным возбудителям (ИФА, РПГА и другие)
  • культуральный посев

Ситуации, когда данные разных методик противоречат друг другу, встречаются, к счастью, не часто. Например – ПЦР положительно, а ИФА положительно.

Такое бывает в конце лечения пациента, когда патогенные микроорганизмы уже уничтожены и в организме человека их нет.

Но антитела (иммуноглобулины) к антигенам возбудителей инфекции еще циркулируют в крови несколько недель или даже месяцев, лет.

При клиническом выздоровлении, такое несоответствие трактуется в пользу ПЦР, так как его результаты более точные, чем исследования на основании антител.

Культуральный посев считается наиболее чувствительным, но для получения его результатов приходится ждать несколько дней или даже недель.

Поэтому бактериологическое исследование проводится только тогда, когда ПЦР не может предоставить гарантированного точного ответа.

Расшифровывать результаты ПЦР анализа

Важно уметь сопоставлять полученные данные анализов и клинические особенности протекания инфекции.

Так, в некоторых случаях результат ПЦР положителен, хотя возбудитель успешно элиминируется иммунной системой.

Так как пациент только что завершил лечение в его организме еще сохраняются погибшие патогенные микроорганизмы.

Их геном будет обнаружен, но все равно тогда положительный результат не означает наличие заболевания.

Ложноотрицательный результат ПЦР анализа возможен:

  • при неправильном подходе к пациенту
  • взятии материала не из нужной биологической среды

Очень большое значение имеет тщательное выяснение всех деталей и нюансов заболевания.

Особое внимание необходимо уделять тому, что и как применял человек от момента появления первых симптомов до обращения за квалифицированной медицинской помощью.

Например – антибиотики, которые можно купить в любой аптеке.

Самолечение часто приводит к значительному сокращению числа микробов из-за чего может случиться ложноотрицательный результат ПЦР анализа.

Похожее:  1 По общности осваиваемого обучающимися содержания образования

То есть роль человека, врача, сводится только к тому, чтоб правильно собрать диагностический материал и затем расшифровать полученные результаты.

Диагностические возможности метода

Этот способ лабораторных исследований очень универсален.

Существует ПЦР диагностика:

  • инфекций, передаваемых половым путем.
    инфекций, передаваемых половым путем.
  • Также некоторых возбудителей респираторных заболеваний (коклюш, бронхосептикоз)
  • особо опасных инфекций (ВИЧ), гепатитов
  • возбудителей кишечных инфекций (ротавирусы, сальмонелла, Helicobacter pylori)
  • вирусов гриппа и др

Источник

ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике

ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.

Суть метода ПЦР

ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.

Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.

Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.

Преимущества метода ПЦР

  1. Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Таким образом, специфичность теста стремится к 100%. Исключен риск ложноположительных результатов.
  2. Чувствительность. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена (или даже уже неактивных – разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве), чтобы он был обнаружен в ходе исследования.
  3. Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент – уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки.
  4. Универсальность. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны.
  5. Диагностика латентных инфекций. ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания.

Какие есть недостатки

Показания к проведению ПЦР-анализа

  • Диагностика инфекционных заболеваний (гепатит, ВИЧ, TORCH-инфекции и огромное множество других видов патогенов).
  • Урогинекология (диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы). Важное значение для женского и мужского здоровья играет ВПЧ – вирус папилломы человека. Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки.
  • Неонатология. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе. Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции.
  • Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность. ПЦР-анализ – главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 (COVID-19), ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий.
  • Генетика. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР.

Подготовка к проведению ПЦР-теста

  • Анализ сдается утром натощак. При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту.
  • При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом.
  • Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток.
  • Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты.

Как проводится ПЦР-анализ

  1. С обратной транскрипцией. Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке.
  2. Вложенная ПЦР (или «гнездовая») — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров.
  3. Изотермические методы – не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны.
  4. Инвертированная ПЦР — применяется, если имеется только короткий фрагмент известной последовательности, но необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
  5. ПЦР в реальном времени — метод, позволяющий определить не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество ее копий после каждого цикла амплификации, что дает возможность для проведения тестов с количественным результатом

Результаты ПЦР-теста

Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.

Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.

Источник

Adblock
detector