Диско-диффузионный метод
Характеристика метода. Полуколичественный. Определяет группы антибиотиков, активных в отношении патогена.
Особенности метода. Используют стандартные диски диаметром 6,25 мм, представляющие собой фильтровальный картон, пропитанный антибиотиком в определенной концентрации.
Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов в концентрации 1,5х10 8 КОЕ/мл, наносят ее в объеме 1 мл на чашку Петри со средой агар Мюллер-Хинтона или АГВ (толщина слоя среды 4±0,5 см). Суспензию распределяют равномерно по поверхности, избыток суспензии удаляют, поверхность среды высушивают, наносят на среду диски на расстоянии 2 см друг от друга и от края, но не более 6 на чашку Петри, инкубируют при 35 0 С 18–24 часа. Можно использовать специальный диспенсер для одновременного нанесения 6 дисков.
Принцип учета. Антибиотик из диска центробежно диффундирует в среду, в месте его действия микроорганизмы погибают, образуя концентрическую зону задержки роста. В остальных участках среды микроорганизмы беспрепятственно растут.
Оценка чувствительности. Определяют диаметр зон задержки роста в мм и сравнивают со стандартными величинами зон задержки роста, на основании чего относят микроорганизмы к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным (рис. 45).
Оценка метода. Простой, нетрудоемкий, относительно дешевый, обладает высокой воспроизводимостью. Основной метод в клинических лабораториях для нетребовательных микроорганизмов.
Источник
Какой бактериофаг поможет в лечении? Определит лабораторный анализ
Б актериофаги – уникальные микроорганизмы. Их антибактериальная активность достигается внедрением в клетку возбудителя, последующим размножением и распадом бактерии. Для лечения бактериальных заболеваний могут применяться либо антибиотики, либо бактериофаги, либо проводят совместную терапию. В каких случаях необходимо назначать антибиотики, а когда – бактериофаги? Все ответы в нашей статье.
Зачем делать анализ
Одна из ключевых проблем, послужившая развитию антибиотикорезистентности бактерий, – неправильное применение антибиотиков или противомикробных препаратов.
Когда к врачу обращается пациент с острым течением заболевания, антибиотики в большинстве случаев назначают сразу, без предварительного определения чувствительности возбудителя.
Специалист назначает антибиотик исходя из собственного опыта, учитывая рекомендации по активности препарата в отношении бактерий, наиболее часто вызывающих данное заболевание. Выбор антибиотика зачастую продиктован клинической ситуацией: необходимо устранить острые симптомы воспаления, что возможно только при ликвидации микроорганизма как причины, его вызывающей. Одновременно с назначением антибиотика врач направляет на анализ по определению чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам и бактериофагам. Результаты анализа обычно готовы в течение 3–4-х дней.
Важные требования к подбору антибактериального препарата на первом этапе: правильная дозировка, узкий спектр активности. Корректное назначение антибиотика определяет возможность формирования к нему устойчивости у бактерий. К сожалению, часто случается наоборот: некорректно назначенный препарат катализирует процесс мутаций у бактерий и формирует устойчивость их к антибиотикам.
Препараты бактериофагов рассматривают как альтернативу антибиотикам. В отличие от антибактериальных препаратов бактериофаги воздействуют только на возбудителя заболевания, не затрагивая нормальную флору человеческого организма. Препараты бактериофагов можно принимать в сочетании с другими антибактериальными средствами, что усиливает противобактериальный эффект и позволяет снизить дозу антибиотика.
Совместное назначение бактериофагов с противовирусными препаратами противопоказано.
Чтобы достичь нужного эффекта при лечении любым антибактериальным препаратом и препаратом бактериофага, необходимо пройти тест на чувствительность возбудителя.
Как проводят тест
Принцип определения чувствительности бактерий к антибиотикам и бактериофагам одинаковый. На первом этапе работают с бактериями, выделенными из патологического содержимого – раны, мочи, мазка со слизистой. Далее в питательную среду добавляют антибиотики разных групп и бактерии.
Антибиотикограмму – перечень антибактериальных препаратов, к которым чувствителен выделенный возбудитель, получают с помощью современных стандартизованных методов: серийных разведений или диффузионных методов (диско-диффузионных и Е-тестов).
Расшифровка результатов анализа
На бланке теста будут обозначения в виде букв R или S. R (Resistant) – резистентность бактерий к данному бактериофагу или антибиотику, S (Sensitive) – чувствительность возбудителя к препарату.
Тест на антибиотико- и фагочувствительность помогает определить, справится препарат с возбудителем инфекции или нет. Это важный показатель, на который ориентируются специалисты при выборе схемы лечения.
АО «НПО «Микроген» выпускает широкий спектр бактериофагов, что расширяет возможности фаготерапии и позволяет корректно подобрать препарат, к которому чувствительны патогенные бактерии.
Источник
Диско-диффузионный тест — Disk diffusion test
Тест диффузии диска (также известный как тест агаровой диффузии , тест Кирби-Бауэр , диск-диффузионный тест на чувствительность к антибиотикам , диск-диффузия тест чувствительности к антибиотикам и KB тест ) является культура основанного микробиологического анализ используется в диагностических и лекарственных средствах обнаружения лабораторий. В диагностических лабораториях анализ используется для определения чувствительности бактерий, выделенных из инфекции пациента, к клинически одобренным антибиотикам. Это позволяет врачам назначать наиболее подходящее лечение антибиотиками. В лабораториях по поиску лекарств, особенно в лабораториях биоразведки , анализ используется для скрининга биологического материала (например, экстрактов растений, бульонов бактериального брожения) и кандидатов в лекарственные препараты на антибактериальную активность. При биоразведке анализ можно проводить с парными штаммами бактерий для достижения дерепликации и предварительного определения антибактериального механизма действия .
В диагностических лабораториях тест проводится путем инокуляции поверхности чашки с агаром бактериями, выделенными из инфекции пациента. Затем на агар прикладывают бумажные диски, содержащие антибиотик, и планшет инкубируют. Если антибиотик останавливает рост бактерий или убивает бактерии , вокруг диска образуется область, где бактерии не разрослись настолько, чтобы их можно было увидеть. Это называется зоной торможения. Восприимчивость бактериального изолята к каждому антибиотику затем может быть определена полуколичественно путем сравнения размера этих зон ингибирования с базами данных информации об известных чувствительных к антибиотикам, умеренно чувствительных и устойчивых бактериях. Таким образом можно определить наиболее подходящий антибиотик для лечения инфекции пациента. Хотя дисковый диффузионный тест нельзя использовать для дифференциации бактериостатической и бактерицидной активности, он менее громоздок, чем другие методы тестирования чувствительности, такие как разведение в бульоне .
В лабораториях по открытию новых лекарств тест диффузии диска выполняется несколько иначе, чем в диагностических лабораториях. В этом случае охарактеризовать должен не штамм бактерий, а тестовый экстракт (например, растительный или микробный экстракт). Поэтому пластину с агаром инокулируют бактериальным штаммом известного фенотипа (часто штаммом АТСС или NCTC ), и диски, содержащие тестовый экстракт, наносят на поверхность. Размеры зоны ингибирования не могут использоваться в качестве полуколичественной меры антибактериальной активности, поскольку разные экстракты содержат молекулы с разными характеристиками диффузии (разные размеры молекул , гидрофильность и т. Д.). Однако размеры зоны запрета можно использовать с целью дерепликации. Это достигается путем тестирования каждого экстракта на парные штаммы бактерий (например, чувствительные к стрептомицину и устойчивые к стрептомицину штаммы для выявления экстрактов, содержащих стрептомицин). Парные штаммы (например, штаммы дикого типа и штаммы- мишени со сверхэкспрессией) также можно использовать для определения антибактериального механизма действия.
СОДЕРЖАНИЕ
История
Впервые диффузию в агар использовал Мартинус Бейеринк в 1889 году для изучения влияния ауксинов на рост бактерий. Тем не менее, этот метод был разработан, усовершенствован и стандартизирован многими учеными и научными организациями на протяжении многих лет, включая Джорджа Ф. Реддиша, Нормана Хитли , Джеймса Г. Винсента, Альфреда Бауэра, Уильяма М.М. Кирби, Джона К. Шерриса, Ханса Мартина. Ericsson, Всемирная организация здравоохранения , Институт клинических и лабораторных стандартов , Шведская референтная группа по антибиотикам, Немецкий институт по нормированию , Британское общество антимикробной химиотерапии и другие.
Принцип
Чистую бактериальную культуру суспендируют в физиологическом растворе, ее мутность стандартизируют и равномерно наносят мазок на чашку с агаром. Затем на поверхность агара помещают диск из фильтровальной бумаги, пропитанный антибиотиком или экстрактом. Компоненты диска диффундируют из фильтровальной бумаги в агар. Концентрация этих компонентов будет максимальной рядом с диском и будет уменьшаться по мере удаления от диска. Если антибиотик или экстракт эффективны против бактерий при определенной концентрации, никакие колонии не будут расти там, где концентрация в агаре больше или равна эффективной концентрации. Это зона торможения. Как правило, более крупные зоны ингибирования коррелируют с более низкими минимальными ингибирующими концентрациями (МПК) антибиотика или экстракта для этого бактериального штамма. Исключение составляют случаи, когда молекулы антибиотика или экстракта большие или гидрофобные, потому что они медленно диффундируют через агар.
Стандартный метод
Чашка с агаром и подготовка посевного материала
Все аспекты процедуры Кирби-Бауэра стандартизированы для обеспечения последовательных и точных результатов. По этой причине лаборатория должна придерживаться этих стандартов. Среда, используемая в тестировании Кирби-Бауэра, должна представлять собой агар Мюллера-Хинтона глубиной всего 4 мм, залитый в чашки Петри диаметром 100 или 150 мм. Уровень pH агара должен быть от 7,2 до 7,4. Бактериальный инокулят готовят путем разбавления бульонной культуры до 0,5 стандарта мутности по Макфарланду , что эквивалентно примерно 150 миллионам клеток на мл.
Посев и инкубация
Используя асептическую технику , бульон культуры конкретного организма собирают с помощью стерильного тампона . В случае грамотрицательных бактерий избыток жидкости удаляется из тампона, осторожно нажимая или вращая его внутри пробирки. Затем мазок наносят штрихами на чашку с агаром Мюллера-Хинтона, чтобы сформировать бактериальный газон. Для достижения равномерного роста на пластину с агаром наносят штрих тампоном в одном направлении, поворачивают на 120 ° и снова наносят штрих, затем снова поворачивают на 120 ° и снова штрихуют. Затем с помощью дозатора дисков с антибиотиками диски, содержащие определенные антибиотики, прикладываются к пластине. Это необходимо сделать в течение 15 минут после посева. Пинцет, стерилизованный пламенем, осторожно прижимает каждый диск к агару и обеспечивает его прикрепление. Затем планшеты инкубируют в течение ночи, обычно при температуре 35 ° C. Планшеты необходимо инкубировать в течение 15 минут после нанесения дисков с антибиотиками.
Альтернативные методы
Было разработано несколько вариантов метода дисковой диффузии, включая методы оксфордской пенициллиновой чашки и Etest, используемые в больничных диагностических лабораториях, а также методы диффузии в скважинах, цилиндрической диффузии и биоавтографии, используемые в лабораториях по открытию и разработке лекарств.
Метод оксфордской чашки пенициллина
Диски, содержащие увеличивающиеся концентрации антибиотиков, помещают на засеянный бактериальный газон на поверхности агара, и чашки инкубируют. Размеры зоны измеряются от края диска до конца чистой зоны. Интерпретация более сложна в популяциях со смешанной восприимчивостью. Они отображаются в виде линейных размеров или квадратов расстояний в зависимости от натурального логарифма концентрации антибиотика в дисках. MIC определяется из нулевой точки пересечения с данными линейной регрессии. Сам перехват — это логарифм ВПК. Наклон линии регрессии связан с коэффициентом диффузии этого конкретного антибиотика в агаре.
Источник
Определение чувствительности к антибиотикам. Как выбрать питательную среду?
Определение чувствительности к антибиотикам – один из наиболее распространенных анализов в клинической микробиологии. Подходов к нему существует несколько. Наибольшей популярностью пользуется метод с использованием бумажных дисков, пропитанных раствором антимикробного вещества.
Принцип диско-диффузионного метода
На питательную среду наносят чистую культуру возбудителя и диски с антимикробным агентом. Через заданное время проводят учет результатов путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах. Чем больше зона подавления роста – тем больше чувствительность микроорганизма к данному антибиотику.
1 – микроорганизм чувствителен к антибиотику
2 – микроорганизм умеренно резистентен к антибиотику
3 – микроорганизм резистентен к антибиотику
Возможности питательных сред
Выбор подходящей питательной среды для диско-диффузионного метода – это ключ к верным результатам. Производители предлагают целый перечень наименований. Ниже описаны возможности различных сред – чтобы вы не потерялись в море предложений и выбрали оптимальную.
Агар Мюллера-Хинтона (Mueller Hinton Agar).
Классическая среда. Дает надежные результаты, широко используется для определения чувствительности к антибиотикам, сульфамидам, а также для первичного выделения Neisseria и других патогенов из клинических образцов.
Агар Мюллера-Хинтона II (Mueller Hinton Agar II).
Оригинальная спецификация агара Мюллера-Хинтона не имела ограничений по катионному составу и количеству тимина и тимидина. Как оказалось, некоторые катионы влияют на эффективность ряда антимикробных веществ, а количество тимина и тимидина вносит погрешность в анализы с использованием триметоприма и триметоприм/сульфометоксазола.
Агар Мюллера-Хинтона II содержит малое количество магния, кальция, тимина и тимидина. Среда рекомендуется для проведения теста на антибиотикочувствительность, а также для первичного выделения гонококков и менингококков из клинических образцов.
Бульон Мюллера-Хинтона (Mueller Hinton Broth).
Отлично подходит для турбидиметрического метода определения чувствительности к антибиотикам.
Агар ISO-Sensitest.
Среда с наиболее постоянным составом, поскольку была разработана с целью полного исключения влияния неконтролируемых примесей на анализ. Использование среды ISO-Sensitest позволяет решить основные проблемы сред Мюллера-Хинтона: наличие антагонистов тетрациклинов, триметоприма и сульфонамида, а также скудные ростовые характеристики для стрептококков и многих грамположительных микроорганизмов.
Среда для Haemophilus (Haemophilus Test Medium).
Подходит для определения чувствительности Haemophilus influenzae.
Надеюсь, этот обзор позволит вам выбрать именно те среды, которые позволят получать достоверные результаты.
Источник